Labormethode
Ziel der Laboruntersuchung ist es, die Dauerkörper von Verticillium, sog. Mikrosklerotien, im Boden nachzuweisen. Sie sind der Ausgangspunkt von Infektionen bzw. eines Neubefalls. Mehr über die Biologie des Erregers erfahren Sie im Bereich WISSEN.
Die Untersuchung gliedert sich in folgende Schritte:
Schritt 1 - Probenvorbereitung
Zur Vorbereitung der Analyse werden die zu untersuchenden Bodenproben bei 20 °C in Plastikschalen luftgetrocknet. Anschließend werden die getrockneten Bodenproben durch ein 2 mm Sieb gesiebt und dabei von größeren Bestandteilen (Steine, Pflanzenreste) befreit. Klumpen werden dabei zerkleinert, so dass die Probe homogenisiert wird. Die gesiebten Proben werden anschließend bis zur weiteren Verarbeitung in verschließbare Probenbecher abgefüllt.
Schritt 2 - Selektivnährmedium
Der quantitative Nachweis von Verticillium im Boden erfolgt nach Harris et al. (1993) mittels eines Plattengussverfahrens mit vorgeschalteter Nasssiebung.
Hierbei wird in Anlehnung an Heppner (1995) ein Pektat-Medium (PEM) nach Huisman (1988) als Selektivnährmedium verwendet. Dieser Nährboden hat sich in Studien als am geeignetsten herausgestellt, da er bei der Auswertung eine sichere Unterscheidung der Verticillium-Kolonien von den Kolonien anderer Pilze erlaubt (Heppner 1995; Akkermann 1999).
Es setzt sich aus verschiedenen Nährsalzen, Pektinen und Antibiotika, sowie Agar-Agar zusammen. Der Ziel pH-Wert im Nährmedium liegt bei 7,0.
Die Antibiotika werden nach dem Autoklavieren in das auf ca. 50°C abgekühlte Medium gegeben. Anschließend erfolgt das Abfüllen des Nährmediums von jeweils 20 ml in Petrischalen (Ø 9 cm).
Schritt 3 - Nasssiebverfahren
Die zu untersuchende luftgetrocknete Bodenprobe wird in einem ersten Schritt nassgesiebt. Hierzu wird lufttrockener Boden in 250 ml Erlenmeyerkolben eingewogen und mit Aqua dest. zu einer 100 ml umfassenden Bodensuspension aufgefüllt. Um alle Bodenteilchen in der Suspension voneinander zu lösen, werden die Kolben bei 200 U/min auf einem Horizontalschüttler geschüttelt.
Die aufgeschlämmte Bodensuspension wird nach dem Schüttelvorgang aus dem Kolben mittels einer Spritzflasche vollständig auf das oberste Sieb mit der Maschenweite von 1000 µm überspült. Darunter folgen Siebe mit 125 µm und 20 µm Maschenweite. Nach dem Verschließen des Siebturms erfolgt die Programmeinstellung der Vibrationssiebmaschine.
Im Rahmen des Siebvorganges wird die Bodenfraktion zwischen 20 und 125 µm abgetrennt. Hierzu wird nach Beendigung des Siebvorganges das auf dem 20 µm Sieb liegende Siebgut mit Hilfe einer Spritzflasche und Aqua dest. in einem Bereich des Siebes zusammengespült und über einen Glastrichter in einen 250 ml Erlenmeyerkolben überführt.
Schritt 4 - Ausplatten auf Nährmedium
Die gesiebte Bodensuspension wird im Erlenmeyerkolben unter der Sterilbank mit einem Rührfisch auf einem Magnetrührer in Bewegung gehalten. Mit einer sterilen Pipettenspitze erfolgt die Entnahme eines Aliquotes aus der Mitte des halben Radius des Erlenmeyerkolbens.
Das Aliquot wird auf den Selektivnährboden (PEM) aufgebracht und mit kreisenden Bewegungen der Nährbodenplatte auf der gesamten Agar-Oberfläche verteilt, so dass eine gleichmäßige Verteilung der Bodensuspension erreicht wird. Danach verbleibt die Nährbodenplatte mit offenem Deckel unter der Sterilbank bis die Bodensuspension angetrocknet ist. Nach dem Antrocknen wird der Deckel aufgelegt.
Schritt 5 - Inkubation und Auswertung
Pro zu untersuchende Bodenprobe werden 10 Platten angelegt. Die Platten werden bei Dunkelheit und 20 °C für 14 Tage im Klimaschrank inkubiert.
Zur Auswertung der Probe wird die Agar-Oberfläche der inkubierten Platten unter langsam fließendem Leitungswasser von Bodenpartikeln und Luftmyzel gesäubert. Anschließend wird unter einer Stereolupe die Oberfläche des Nährbodens nach Verticillium-Kolonien abgesucht und ihre Anzahl pro Platte ermittelt.
Auf der Basis der durchschnittlichen Kolonienanzahl pro Platte wird die Anzahl colony forming units (cfu) pro Gramm trockener Boden berechnet. Die cfu/g Boden werden mit der Anzahl
Mikrosklerotien pro Gramm Boden gleichgesetzt. Der Wert spiegelt den Verseuchungsgrad einer Bodenprobe wieder.
Auf der Grundlage des ermittelten Verseuchungsgrades werden die Bodenproben nach Neubauer (2000, 2001) in verschiedene Befallsklassen unterteilt und das jeweilige Befallsrisiko für eine anfällige
Wirtspflanze geschätzt.
Literatur:
- Akkermann, E. (1999): Untersuchung zur Genauigkeit des quantitativen Nachweises von Verticillium dahliae Kleb. im Boden mittels Plattengußverfahren. Diplomarbeit der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, Studiengang Diplom – Biologie.
- Harris, D. C., Yang, J. R., Ridout, M. S. (1993): The detection and estimation of Verticillium dahliae in naturally infested soil. Plant Pathology, Bd. 42, S. 238-250.
- Heppner, C. (1995): Nachweis von Verticillium dahliae Kleb. im Boden mit Plattengussverfahren und ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sowie Untersuchungen zur Auswirkung des Inokulums auf den Befall von Winterraps (Brassica napus ssp. oleifera Metzg.). Dissertation der Georg-August-Universität zu Göttingen, Fachbereich Agrarwissenschaften.
- Huisman, O. C. (1988): Seasonal Colonization of Roots of Field-Grown Cotton by Verticillium dahliae and V. tricorpus. Phytopathology, Bd. 78, S. 708-716.
- Neubauer, C. (2000): Bodenuntersuchungen auf Verticillium-Grundlage für die Flächenauswahl im Erdbeeranbau. Obstbau, 4, 196-198.
- Neubauer, C. (2001): Gefahr durch Verticillium in der Baumschule, Deutsche Baumschule, 9, 37-40.
- Neubauer, C., Heitmann B. (2011): Quantitativer Nachweis von Verticillium dahliae im Boden als Grundlage der Flächenauswahl im Gartenbau, Journal für Kulturpflanzen, 63 (1). S. 1-8, 2011.